生化試驗的核心分類與典型方法及通用操作原則與注意事項！
小楊 / 2025-11-17 10:40:12
百歐博偉生物：生化試驗是微生物學、生物化學、醫(yī)學檢驗等領(lǐng)域的核心技術(shù)，通過檢測生物體內(nèi)（或體外培養(yǎng)體系中）的代謝產(chǎn)物、酶活性、物質(zhì)轉(zhuǎn)化等生化反應(yīng)，實現(xiàn)微生物鑒定、細胞功能分析、疾病診斷、藥物篩選等目的。以下從核心分類、原理與操作細節(jié)、應(yīng)用場景、質(zhì)量控制四個維度，系統(tǒng)梳理生化試驗的方法體系，突出實操性和標準化要求：
一、生化試驗的核心分類及典型方法
按檢測對象和反應(yīng)類型，生化試驗可分為微生物生化鑒定試驗、細胞生化功能試驗、臨床生化檢測試驗三大類，每類包含多個經(jīng)典方法，具體如下：
（一）微生物生化鑒定試驗（最常用，聚焦微生物代謝特征）
核心邏輯：不同微生物的酶系統(tǒng)不同，對營養(yǎng)物質(zhì)的分解能力和代謝產(chǎn)物存在差異，通過檢測這些差異實現(xiàn)菌種鑒定（如細菌、真菌的屬種分類）。
試驗類型 典型方法 原理 操作步驟（以細菌為例） 結(jié)果判斷標準
碳水化合物代謝試驗 糖發(fā)酵試驗 細菌分解糖類產(chǎn)生有機酸，使培養(yǎng)基 pH 降低，指示劑變色；若產(chǎn)氣體，可觀察到氣泡。 1.配置含糖發(fā)酵培養(yǎng)基（含特定糖類、酚紅指示劑）；2.無菌操作接種純培養(yǎng)細菌；3.37℃培養(yǎng) 18-24h；4.觀察培養(yǎng)基顏色和 Durham 管氣泡。 陽性：培養(yǎng)基變黃（pH<6.8），產(chǎn)氣則 Durham 管有氣泡；陰性：培養(yǎng)基仍為紅色，無氣泡。
淀粉水解試驗 細菌產(chǎn)生淀粉酶，分解培養(yǎng)基中的淀粉為麥芽糖/葡萄糖，碘液可與淀粉結(jié)合呈藍色，若淀粉被分解則藍色消失。 1.配置淀粉瓊脂平板；2.接種細菌（點種或劃線）；3.37℃培養(yǎng) 24-48h；4.平板表面滴加碘液，靜置 1min。 陽性：菌落周圍出現(xiàn)無色透明圈；陰性：無透明圈，平板整體呈藍色。
蛋白質(zhì)/氨基酸代謝試驗 吲哚試驗 細菌分解色氨酸產(chǎn)生吲哚，吲哚與對二甲基氨基苯甲醛結(jié)合呈玫瑰紅色。 1.配置色氨酸肉湯培養(yǎng)基；2.接種細菌，37℃培養(yǎng) 24h；3.加入 Ehrlich 試劑 0.5mL，靜置 10min。 陽性：培養(yǎng)基上層出現(xiàn)玫瑰紅色；陰性：無顏色變化。
酶活性試驗 過氧化氫酶試驗 細菌產(chǎn)生過氧化氫酶，分解 H?O?生成 O?和 H?O，產(chǎn)生氣泡。 1.取細菌純培養(yǎng)物涂于載玻片；2.滴加 3% H?O?溶液 1-2 滴；3.立即觀察氣泡產(chǎn)生。 陽性：10s 內(nèi)產(chǎn)生大量氣泡；陰性：無氣泡或極少氣泡。
氧化酶試驗 細菌產(chǎn)生細胞色素氧化酶，可將氧化酶試劑氧化為紫色化合物。 1.用無菌棉簽蘸取細菌純培養(yǎng)物；2.滴加氧化酶試劑 1 滴；3.觀察 10-30s 內(nèi)顏色變化。 陽性：棉簽變?yōu)樽仙魂幮裕簾o顏色變化（注意：試劑本身易氧化，需現(xiàn)配現(xiàn)用）。
（二）細胞生化功能試驗（聚焦細胞代謝、酶活性、物質(zhì)轉(zhuǎn)運）
核心邏輯：檢測細胞在生理或病理狀態(tài)下的生化反應(yīng)，反映細胞功能完整性。
試驗類型 典型方法 原理 關(guān)鍵操作細節(jié) 應(yīng)用場景
細胞酶活性檢測 乳酸脫氫酶（LDH）活性測定（比色法） LDH 催化乳酸轉(zhuǎn)化為丙酮酸，同時將 NAD?還原為 NADH，NADH 在 340nm 處有特征吸收峰，通過吸光度變化計算酶活性。 1.制備細胞裂解液；2.加入反應(yīng)底物；3.37℃孵育 10min，終止反應(yīng)；4.紫外分光光度計檢測 340nm 吸光度。 細胞損傷程度評估、腫瘤標志物檢測。
堿性磷酸酶（ALP）活性測定（PNPP 法） ALP 催化對硝基苯磷酸酯（PNPP）水解為對硝基苯酚（PNP），PNP 在 405nm 處有吸收峰，吸光度與酶活性正相關(guān)。 1.細胞裂解液與 PNPP 底物緩沖液混合；2.37℃孵育 30min；3.加入 NaOH 終止反應(yīng)；4.酶標儀檢測 405nm 吸光度。 干細胞分化（如成骨細胞分化）、肝膽疾病診斷。
細胞代謝產(chǎn)物檢測 糖酵解產(chǎn)物（乳酸）檢測（酶法） 乳酸脫氫酶催化乳酸與 NAD?反應(yīng)，生成 NADH，通過熒光強度定量乳酸含量。 1.收集細胞培養(yǎng)上清或細胞勻漿；2.加入乳酸檢測試劑盒試劑（含 LDH、NAD?）；3.避光孵育 20min；4.熒光分光光度計檢測（激發(fā)波長 340nm，發(fā)射波長 460nm）。 腫瘤細胞代謝表型分析、細胞缺氧狀態(tài)評估。
細胞物質(zhì)轉(zhuǎn)運試驗 葡萄糖轉(zhuǎn)運體（GLUT）功能檢測（放射性同位素法） 細胞攝取 ¹?C - 葡萄糖，通過檢測細胞內(nèi)放射性強度，反映 GLUT 介導的葡萄糖轉(zhuǎn)運效率。 1.細胞接種于 24 孔板，培養(yǎng)至匯合；2.無血清培養(yǎng)基饑餓處理 2h；3.加入含 ¹?C - 葡萄糖的反應(yīng)液，37℃孵育 5-10min；4.冰浴終止反應(yīng)，洗滌細胞，裂解后檢測放射性計數(shù)（CPM）。 糖尿病相關(guān)研究、腫瘤細胞糖代謝調(diào)控。
細胞解毒功能試驗 肝細胞 P450 酶活性檢測（熒光底物法） 肝細胞 P450 酶催化熒光底物代謝，生成熒光產(chǎn)物，熒光強度與酶活性正相關(guān)。 1.原代肝細胞或肝細胞系培養(yǎng)至對數(shù)期；2.加入熒光底物，37℃孵育 1-2h；3.收集上清，熒光酶標儀檢測。 藥物代謝研究、肝毒性評價、藥物相互作用分析。
二、生化試驗的通用操作原則與注意事項（保證結(jié)果可靠性）
無論哪種生化試驗，都需遵循以下標準化流程和質(zhì)量控制要求，避免誤差：
1、樣品制備的標準化
微生物樣品：需采用純培養(yǎng)物（通過平板分離獲得單菌落），避免雜菌污染；菌液濃度需一致（如標準比濁管校準，常用 0.5 麥氏濁度，約 1.5×10? CFU/mL）。
細胞樣品：細胞純度≥90%，裂解液需新鮮制備（加入蛋白酶抑制劑如 PMSF，防止酶降解）；培養(yǎng)上清需離心去除細胞碎片（1000rpm，5min）。
臨床樣品：血液樣品需及時分離血清/血漿（采血后 2h 內(nèi)離心，避免溶血）；尿液樣品需新鮮采集（冷藏保存不超過 4h），避免污染。
2、試劑與培養(yǎng)基的質(zhì)量控制
試劑需在有效期內(nèi)使用，嚴格按照說明書儲存（如酶類試劑需 - 20℃避光保存，避免反復(fù)凍融）；
培養(yǎng)基配制后需高壓滅菌（121℃，15-20min），冷卻后無菌分裝，接種前需做空白對照（未接種培養(yǎng)基培養(yǎng)后觀察，確認無雜菌污染）；
指示劑需現(xiàn)配現(xiàn)用，避免氧化失效。
3、反應(yīng)條件的精準控制
溫度：多數(shù)細菌生化試驗為 37℃，真菌為 28℃，細胞酶活性試驗需嚴格控制孵育溫度（±0.5℃）；
時間：嚴格遵循孵育時間（如糖發(fā)酵試驗 18-24h，超過 48h 可能因雜代謝產(chǎn)物導致假陽性）；
pH：反應(yīng)體系 pH 需符合要求（如糖發(fā)酵培養(yǎng)基 pH7.2-7.4，酶活性試驗需用特定緩沖液維持 pH 穩(wěn)定）。
4、結(jié)果判斷的標準化
對照設(shè)置：每個試驗需設(shè)陽性對照（已知陽性菌株/標準品）、陰性對照（已知陰性菌株/空白試劑）、空白對照（無樣品的反應(yīng)體系），排除干擾；
定量試驗：需做標準曲線（如酶活性、代謝產(chǎn)物檢測），標準品濃度梯度至少 3 個點，R²≥0.99；
定性試驗：嚴格按照指示劑變色標準判斷（如酚紅變色范圍 pH6.8-8.4，避免主觀判斷誤差）。
5、常見誤差來源與解決方法
誤差類型 可能原因 解決方法
假陽性 樣品污染、試劑失效、孵育時間過長 嚴格無菌操作；使用新鮮試劑；按時終止反應(yīng)。
假陰性 菌液濃度過低、酶活性受抑制、底物濃度不足 校準菌液濃度；優(yōu)化反應(yīng)溫度；確保底物過量。
定量結(jié)果偏高/偏低 標準曲線繪制不準確、樣品稀釋倍數(shù)錯誤 標準品梯度均勻；稀釋時使用移液槍精準操作，做平行樣。
重復(fù)性差 反應(yīng)條件不一致、樣品處理差異 統(tǒng)一緩沖液配方；樣品處理步驟標準化（如裂解時間、離心轉(zhuǎn)速）。
三、生化試驗的核心應(yīng)用場景
微生物學：細菌/真菌的屬種鑒定（如臨床病原菌鑒定、環(huán)境微生物篩選）、微生物代謝產(chǎn)物篩選；
細胞生物學：細胞功能評估（如干細胞分化、腫瘤細胞代謝表型）、藥物毒性檢測；
臨床醫(yī)學：疾病診斷（如糖尿病、肝炎、腎功能不全）、療效監(jiān)測（如化療后腫瘤標志物變化）、健康體檢（血脂、血糖篩查）；
工業(yè)生物技術(shù)：發(fā)酵過程監(jiān)控（如糖消耗、產(chǎn)物生成）、酶制劑生產(chǎn)工藝優(yōu)化（如酶活性測定）；
環(huán)境科學：水體/土壤污染監(jiān)測（如微生物降解能力檢測、重金屬對酶活性的抑制）。
四、生化試驗的標準化規(guī)程（ISO/CLSI 參考）
為確保結(jié)果的可比性和合規(guī)性，國際上有明確的標準化規(guī)程，常用參考標準：
臨床生化：ISO 15189（醫(yī)學實驗室質(zhì)量和能力認可準則）、CLSI C28-A3（臨床化學試劑性能評價指南）；
微生物生化鑒定：CLSI M35-A2（微生物體外抗菌藥物敏感性試驗執(zhí)行標準）、ISO 6579（食品中沙門氏菌檢測方法）；
細胞生化：ISO 10993-5（醫(yī)療器械生物學評價 第 5 部分：體外細胞毒性試驗）。
遵循這些標準時，需重點關(guān)注：試劑校準、設(shè)備驗證（如分光光度計、酶標儀的定期校準）、人員操作培訓、實驗記錄完整性（如樣品信息、反應(yīng)條件、結(jié)果數(shù)據(jù)）。
五、總結(jié)
生化試驗的核心是通過特異性生化反應(yīng)檢測目標物質(zhì)或酶活性，其可靠性依賴于樣品制備標準化、反應(yīng)條件精準控制、質(zhì)量對照完善。不同領(lǐng)域的生化試驗雖有差異，但均需遵循“原理明確、操作規(guī)范、結(jié)果可重復(fù)”的原則。在實際應(yīng)用中，需根據(jù)檢測目的（如微生物鑒定、細胞功能分析、臨床診斷）選擇合適的方法，并結(jié)合具體場景優(yōu)化操作細節(jié)，同時嚴格執(zhí)行質(zhì)量控制流程，確保結(jié)果的準確性和合規(guī)性。
北京百歐博偉生物技術(shù)有限公司擁有對菌種、細胞、培養(yǎng)基、配套試劑等產(chǎn)品需求者的極優(yōu)質(zhì)服務(wù)，對購買項目的前期資料提供,中期合同保證,后期貨物跟蹤到最終售后的確保項目準確到位，都有相關(guān)人士進行維護,確保您在
微生物菌種查詢網(wǎng)中獲得最優(yōu)質(zhì)服務(wù)！也正因為此，北京百歐博偉生物技術(shù)有限公司與國內(nèi)外多家研制單位、生物制藥、第三方檢測機構(gòu)和科研院所院校、化工企業(yè)有著良好、長期和穩(wěn)定的合作關(guān)系！
下載附件
上一篇：進入無菌室前標準化操作指南：人員與物品凈化及環(huán)境預(yù)準備
下一篇：真菌生化反應(yīng)與細菌生化反應(yīng)的主要區(qū)別及其應(yīng)用領(lǐng)域！