瓊脂稀釋法的核心原理與操作流程及適用范圍與標(biāo)準(zhǔn)化要點(diǎn)！
小楊 / 2025-11-13 09:54:35
百歐博偉生物：瓊脂稀釋法是微生物藥物敏感性檢測(cè)的經(jīng)典方法，尤其適用于需氧菌、厭氧菌及真菌的最低抑菌濃度（MIC）測(cè)定，具有結(jié)果準(zhǔn)確、重復(fù)性好、可批量檢測(cè)的特點(diǎn)，被 CLSI（臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會(huì)）、EUCAST（歐洲抗菌藥物敏感性試驗(yàn)委員會(huì)）等權(quán)威機(jī)構(gòu)列為標(biāo)準(zhǔn)化方法之一。以下從核心原理、操作細(xì)節(jié)、質(zhì)量控制、應(yīng)用場(chǎng)景及優(yōu)化策略展開(kāi)，為實(shí)驗(yàn)室規(guī)范化操作提供系統(tǒng)指導(dǎo)。
一、核心原理
將不同濃度的抗菌藥物與融化的瓊脂培養(yǎng)基均勻混合，制成含梯度藥物濃度的瓊脂平板；隨后將標(biāo)準(zhǔn)化的微生物菌液接種至平板表面，經(jīng)適宜溫度培養(yǎng)后，觀察細(xì)菌/真菌的生長(zhǎng)情況。抑制微生物可見(jiàn)生長(zhǎng)的最低藥物濃度，即為該菌株的 MIC 值，可直接用于判斷菌株對(duì)藥物的敏感（S）、中介（I）或耐藥（R）狀態(tài)。
關(guān)鍵邏輯：
藥物與瓊脂的均勻結(jié)合保證了藥物濃度的穩(wěn)定性，避免液體稀釋法中藥物擴(kuò)散導(dǎo)致的濃度不均；
接種菌量的標(biāo)準(zhǔn)化是結(jié)果可靠的核心（需控制在特定范圍，如細(xì)菌 10? CFU/點(diǎn)，真菌 10³~10? CFU/點(diǎn)），確保生長(zhǎng)抑制僅由藥物濃度決定。
二、適用范圍與局限性
1、適用對(duì)象
細(xì)菌：需氧菌（如腸桿菌科、葡萄球菌屬、鏈球菌屬）、厭氧菌；
真菌：念珠菌屬、曲霉屬等常見(jiàn)致病性真菌；
藥物類(lèi)型：抗生素、抗真菌藥、抗菌肽等。
2、局限性
操作較繁瑣，耗時(shí)較長(zhǎng)（細(xì)菌 16~20h，真菌 24~48h），不適用于緊急藥敏需求；
對(duì)苛養(yǎng)菌（如
嗜血桿菌屬、
淋病奈瑟菌）需特殊培養(yǎng)基，且藥物穩(wěn)定性需額外驗(yàn)證；
難以檢測(cè)微量耐藥機(jī)制，需結(jié)合其他方法輔助確認(rèn)。
三、標(biāo)準(zhǔn)化操作流程（以細(xì)菌藥敏為例）
1、實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備
（1）試劑與材料
抗菌藥物：標(biāo)準(zhǔn)品（純度≥98%），按 CLSI/EUCAST 標(biāo)準(zhǔn)確定稀釋濃度范圍（如青霉素對(duì)葡萄球菌的濃度梯度：0.125~128 μg/mL）；
培養(yǎng)基：MH 瓊脂（ Mueller-Hinton agar，需氧菌專(zhuān)用）、布氏瓊脂（厭氧菌專(zhuān)用），pH 需校準(zhǔn)至 7.2~7.4（真菌培養(yǎng) pH 7.0~7.2）；
菌液制備工具：比濁管（0.5 麥?zhǔn)蠁挝唬?、無(wú)菌生理鹽水/肉湯、微量移液器（精度≥0.1 μL）；
接種工具：多點(diǎn)接種儀（推薦，可同時(shí)接種 8~12 個(gè)菌株）或無(wú)菌接種環(huán)（直徑 3mm）。
（2）儀器設(shè)備
恒溫培養(yǎng)箱（35±2℃，厭氧菌需厭氧培養(yǎng)箱）；
高壓蒸汽滅菌鍋（培養(yǎng)基滅菌）、干熱滅菌箱（玻璃器皿滅菌）；
超凈工作臺(tái)（無(wú)菌操作）；
比濁儀（替代麥?zhǔn)媳葷峁?，提高菌液濃度?zhǔn)確性）。
2、操作步驟（核心環(huán)節(jié) + 關(guān)鍵控制點(diǎn)）
步驟 1：抗菌藥物梯度稀釋?zhuān)ê诵模簼舛葴?zhǔn)確 + 無(wú)污染）
儲(chǔ)備液制備：用適宜溶劑溶解藥物標(biāo)準(zhǔn)品，配制成高濃度儲(chǔ)備液，分裝后 - 20℃避光保存（有效期 3~6 個(gè)月，具體按藥物穩(wěn)定性確定）；
工作液稀釋?zhuān)喝?chǔ)備液用 MH 肉湯進(jìn)行倍比稀釋?zhuān)苽渌铦舛忍荻?，每個(gè)濃度設(shè) 1 管，每管體積 1 mL；
注意事項(xiàng)：
溶劑體積占比≤1%（避免溶劑對(duì)微生物生長(zhǎng)的抑制）；
不穩(wěn)定藥物需現(xiàn)配現(xiàn)用，或在冰浴條件下操作。
步驟 2：含藥瓊脂平板制備（核心：藥物與瓊脂均勻混合）
培養(yǎng)基融化：將 MH 瓊脂加熱融化，冷卻至 45~50℃（手感不燙手，避免高溫破壞藥物活性）；
藥物添加與混合：取 1 mL 藥物工作液加入 9 mL 融化的 MH 瓊脂中，快速顛倒混勻（避免氣泡產(chǎn)生），立即倒入無(wú)菌培養(yǎng)皿（直徑 90mm），每皿約 20 mL，水平放置待凝固（室溫 1~2h 或 4℃冷藏 30min）；
空白對(duì)照：設(shè)置不含藥物的 MH 瓊脂平板（僅加 1 mL 無(wú)菌肉湯），用于驗(yàn)證菌液活性；
注意事項(xiàng)：
每批平板需標(biāo)記藥物名稱(chēng)、濃度、制備日期；
凝固后的平板 4℃密封保存，有效期≤7 天（含不穩(wěn)定藥物的平板需現(xiàn)配現(xiàn)用）。
步驟 3：菌液標(biāo)準(zhǔn)化制備（核心：控制接種菌量）
挑取純菌落：從新鮮培養(yǎng)的平板上挑取 3~5 個(gè)形態(tài)一致的純菌落，接種至 5 mL MH 肉湯中，35℃振蕩培養(yǎng) 4~6h（對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期）；
濃度校準(zhǔn)：取培養(yǎng)后的菌液，用無(wú)菌生理鹽水稀釋至 0.5 麥?zhǔn)蠁挝唬ㄏ喈?dāng)于 1.5×10? CFU/mL），或用比濁儀直接測(cè)定（誤差≤10%）；
進(jìn)一步稀釋?zhuān)簩?0.5 麥?zhǔn)蠁挝痪河?MH 肉湯稀釋 100 倍，得到 1.5×10? CFU/mL 的菌液（最終接種濃度需為 10? CFU / 點(diǎn)）；
注意事項(xiàng)：
菌液制備后需在 15min 內(nèi)接種，避免細(xì)菌死亡；
若為厭氧菌，需在厭氧環(huán)境下制備菌液，避免氧氣暴露。
步驟 4：接種與培養(yǎng)（核心：均勻接種 + 適宜培養(yǎng)條件）
接種方式：
多點(diǎn)接種儀：將標(biāo)準(zhǔn)化菌液加入接種儀樣品池，每塊平板可接種 8~12 個(gè)菌株，每個(gè)菌株接種 1~2 μL（相當(dāng)于 10? CFU / 點(diǎn)），接種點(diǎn)直徑≤5mm；
接種環(huán)：用無(wú)菌接種環(huán)（直徑 3mm）蘸取菌液，在平板表面點(diǎn)種，每點(diǎn)接種量約 1 μL，避免劃破瓊脂表面；
培養(yǎng)條件：
需氧菌：35±2℃，有氧培養(yǎng) 16~20h；
厭氧菌：35±2℃，厭氧環(huán)境（85% N?、10% H?、5% CO?）培養(yǎng) 48h；
真菌：35℃，有氧培養(yǎng) 24~48h（念珠菌）或 72h（曲霉）；
注意事項(xiàng)：
接種后平板需倒置培養(yǎng)，避免冷凝水滴落影響菌落生長(zhǎng)；
培養(yǎng)期間避免頻繁開(kāi)關(guān)培養(yǎng)箱，保持溫度穩(wěn)定。
步驟 5：結(jié)果判讀（核心：準(zhǔn)確識(shí)別 MIC 值）
觀察生長(zhǎng)情況：培養(yǎng)結(jié)束后，首先檢查空白對(duì)照平板（需有明顯菌落生長(zhǎng)，否則實(shí)驗(yàn)無(wú)效）；
MIC 判讀標(biāo)準(zhǔn)：
細(xì)菌：以“完全抑制菌落生長(zhǎng)（僅允許單個(gè)菌落或輕微菌膜，且面積≤接種點(diǎn)的 10%）”的最低藥物濃度為 MIC；
真菌：念珠菌以“菌落直徑≤1mm”的最低濃度為 MIC，曲霉以“無(wú)可見(jiàn)菌絲生長(zhǎng)”的最低濃度為 MIC；
結(jié)果記錄：按 CLSI/EUCAST 標(biāo)準(zhǔn)將 MIC 值轉(zhuǎn)化為敏感（S）、中介（I）、耐藥（R）；
注意事項(xiàng)：
若出現(xiàn)“跳孔生長(zhǎng)”（低濃度抑制、高濃度生長(zhǎng)），需重新實(shí)驗(yàn)；
對(duì)凝固酶陰性葡萄球菌，需排除污染，確保菌落純度。
四、質(zhì)量控制（QC）要點(diǎn)（確保結(jié)果可靠的核心）
1、標(biāo)準(zhǔn)菌株驗(yàn)證
每批實(shí)驗(yàn)需同時(shí)接種 CLSI 推薦的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)控菌株，驗(yàn)證藥物濃度和培養(yǎng)條件的準(zhǔn)確性：
要求：質(zhì)控菌株的 MIC 值需在 CLSI 規(guī)定的參考范圍內(nèi)，否則實(shí)驗(yàn)結(jié)果無(wú)效。
2、培養(yǎng)基質(zhì)量控制
外觀：融化后澄清透明，無(wú)沉淀、顆粒；
pH：7.2~7.4（需氧菌）、7.0~7.2（真菌），誤差≤0.2；
無(wú)菌性：每批培養(yǎng)基隨機(jī)取 3~5 皿，35℃培養(yǎng) 24h，無(wú)雜菌生長(zhǎng)；
生長(zhǎng)支持性：接種標(biāo)準(zhǔn)菌株后，菌落形態(tài)正常、生長(zhǎng)良好（菌落直徑≥1mm）。
3、藥物質(zhì)量控制
純度：使用≥98% 的藥物標(biāo)準(zhǔn)品，避免雜質(zhì)影響 MIC 值；
穩(wěn)定性：定期驗(yàn)證儲(chǔ)備液和工作液的穩(wěn)定性（如每月檢測(cè) 1 次儲(chǔ)備液的 MIC 值，與初始值對(duì)比，偏差≤2 倍稀釋度）；
濃度準(zhǔn)確性：稀釋過(guò)程中使用校準(zhǔn)過(guò)的移液器，避免體積誤差（允許誤差≤5%）。
4、操作過(guò)程質(zhì)控
無(wú)菌操作：全程在超凈工作臺(tái)進(jìn)行，避免雜菌污染（尤其是厭氧菌和真菌，污染后易誤判）；
接種菌量驗(yàn)證：定期用傾注平板法計(jì)數(shù)接種后的菌液濃度，確保實(shí)際接種量在 10?±30% CFU / 點(diǎn)；
判讀人員培訓(xùn)：多人復(fù)核判讀結(jié)果，避免主觀誤差（如對(duì)“輕微生長(zhǎng)”的判斷標(biāo)準(zhǔn)統(tǒng)一）。
五、常見(jiàn)問(wèn)題與解決方案
問(wèn)題類(lèi)型 可能原因 解決方案
質(zhì)控菌株 MIC 值超標(biāo) 藥物失效、培養(yǎng)基 pH 異常、接種菌量不當(dāng) 更換藥物標(biāo)準(zhǔn)品，校準(zhǔn)培養(yǎng)基 pH，重新標(biāo)準(zhǔn)化菌液濃度
平板上無(wú)菌落生長(zhǎng)（空白對(duì)照也無(wú)） 菌液濃度過(guò)低、菌液死亡、培養(yǎng)基抑制生長(zhǎng) 重新制備對(duì)數(shù)期菌液，驗(yàn)證培養(yǎng)基生長(zhǎng)支持性，縮短菌液放置時(shí)間
跳孔生長(zhǎng)（低濃度抑制、高濃度生長(zhǎng)） 藥物濃度不均、菌液污染、耐藥突變 重新制備含藥平板，確保藥物與瓊脂充分混勻；驗(yàn)證菌液純度，必要時(shí)重新分離純菌落
所有濃度均無(wú)抑制（MIC＞最高濃度） 菌株耐藥、藥物濃度范圍設(shè)置過(guò)低 擴(kuò)大藥物濃度范圍，結(jié)合其他方法檢測(cè)耐藥基因
所有濃度均完全抑制（MIC＜最低濃度） 藥物濃度過(guò)高、接種菌量不足 調(diào)整藥物濃度梯度（降低最低濃度），重新校準(zhǔn)菌液濃度
六、應(yīng)用場(chǎng)景與拓展
1、臨床應(yīng)用
指導(dǎo)臨床合理用藥：通過(guò)測(cè)定致病菌的 MIC 值，為重癥感染選擇有效抗菌藥物，避免盲目用藥導(dǎo)致的耐藥性和治療失敗；
耐藥性監(jiān)測(cè)：定期對(duì)臨床分離菌株進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，分析地區(qū)性耐藥趨勢(shì)，為抗菌藥物使用政策制定提供數(shù)據(jù)支持。
2、科研應(yīng)用
新藥研發(fā)：測(cè)定候選藥物對(duì)目標(biāo)菌株的 MIC 值，評(píng)估抗菌活性，篩選有效藥物分子；
耐藥機(jī)制研究：通過(guò)比較耐藥株與敏感株的 MIC 差異，驗(yàn)證耐藥基因的功能；
抗菌藥物聯(lián)合藥敏：采用棋盤(pán)法瓊脂稀釋法，測(cè)定兩種藥物聯(lián)合使用的 MIC 值，評(píng)估協(xié)同（FIC 指數(shù)≤0.5）、相加（0.5＜FIC≤1）、無(wú)關(guān)（1＜FIC≤2）或拮抗（FIC＞2）作用。
3、工業(yè)應(yīng)用
食品微生物檢測(cè)：測(cè)定食品中致病菌（如
沙門(mén)氏菌、
李斯特菌）對(duì)防腐劑、抗菌劑的敏感性，優(yōu)化食品保鮮配方；
畜牧獸醫(yī)領(lǐng)域：檢測(cè)畜禽致病菌對(duì)抗菌藥物的 MIC 值，指導(dǎo)養(yǎng)殖業(yè)合理用藥，減少耐藥菌向人類(lèi)傳播。
七、方法優(yōu)化與標(biāo)準(zhǔn)化建議
自動(dòng)化與高通量改進(jìn)：使用自動(dòng)化瓊脂稀釋平板制備儀和菌落成像分析系統(tǒng)，減少人工操作誤差，提高檢測(cè)效率（可同時(shí)處理 96 孔平板，批量檢測(cè)菌株）；
培養(yǎng)基優(yōu)化：對(duì)苛養(yǎng)菌（如
流感嗜血桿菌），在 MH 瓊脂中添加 X/V 因子（10 μg/mL）或脫纖維羊血（5%~10%），增強(qiáng)生長(zhǎng)支持性；
藥物穩(wěn)定性改進(jìn)：對(duì)熱不穩(wěn)定藥物，采用過(guò)濾除菌（0.22 μm 濾膜）替代高壓滅菌，避免藥物降解；
八、總結(jié)
瓊脂稀釋法是微生物藥敏試驗(yàn)的“金標(biāo)準(zhǔn)”，其核心優(yōu)勢(shì)在于結(jié)果準(zhǔn)確、重復(fù)性強(qiáng)，適用于臨床診斷、科研和工業(yè)領(lǐng)域的 MIC 測(cè)定。實(shí)驗(yàn)室操作中需嚴(yán)格控制藥物濃度、接種菌量、培養(yǎng)基質(zhì)量和培養(yǎng)條件，通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)化質(zhì)控流程確保結(jié)果可靠。隨著自動(dòng)化技術(shù)的發(fā)展，瓊脂稀釋法正逐漸向高通量、智能化方向升級(jí)，但其“梯度藥物 + 固體培養(yǎng)基”的核心原理仍為藥敏檢測(cè)的基礎(chǔ)，是耐藥性監(jiān)測(cè)和抗菌藥物合理使用的關(guān)鍵技術(shù)支撐。
北京百歐博偉生物技術(shù)有限公司擁有對(duì)菌種、細(xì)胞、培養(yǎng)基、配套試劑等產(chǎn)品需求者的極優(yōu)質(zhì)服務(wù)，對(duì)購(gòu)買(mǎi)項(xiàng)目的前期資料提供,中期合同保證,后期貨物跟蹤到最終售后的確保項(xiàng)目準(zhǔn)確到位，都有相關(guān)人士進(jìn)行維護(hù),確保您在
微生物菌種查詢(xún)網(wǎng)中獲得最優(yōu)質(zhì)服務(wù)！也正因?yàn)榇?，北京百歐博偉生物技術(shù)有限公司與國(guó)內(nèi)外多家研制單位、生物制藥、第三方檢測(cè)機(jī)構(gòu)和科研院所院校、化工企業(yè)有著良好、長(zhǎng)期和穩(wěn)定的合作關(guān)系！
下載附件
上一篇：檢驗(yàn)工作中無(wú)菌操作的核心原則與標(biāo)準(zhǔn)流程及質(zhì)量控制！
下一篇：人體隱形軍隊(duì)：揭秘免疫細(xì)胞如何守護(hù)你的健康防線？